fa بیان دو سیسترونی و پایدار فاکتور 9 انعقادی انسانی و پروتئین فلورسنت سبز تقویت شده در سلول‌های تخمدان همستر چینی سازگار با کشت معلق بیوتکنولوژی Biotechnology پژوهشي اصیل Original Research <span style="font-size:12pt"><span style="text-justify:kashida"><span style="text-kashida:0%"><span style="line-height:normal"><span style="direction:rtl"><span style="unicode-bidi:embed"><span new="" roman="" style="font-family:" times=""><span b="" lang="FA" style="font-family:" zar=""><b>زمینه و هدف</b><font color="#0782c1"><b>:</b></font>&nbsp;درمان فعلی هموفیلی </span><span dir="LTR" style="font-size:11.0pt">B</span><span b="" lang="FA" style="font-family:" zar=""> درمان جایگزینی است که شامل تزریق داخل وریدی فاکتور 9 انسانی خالص شده از پلاسما یا فرم نوترکیب تولید شده در سلول‌های پستانداران است. در تحقیق حاضر با استفاده از یک سیستم بیانی دو سیسترونی، بیان پایدار فاکتور 9 انسانی در ردۀ سلولی تخمدان همستر چینی</span> <span b="" lang="FA" style="font-family:" zar="">سازگار با کشت معلق </span><span dir="LTR" style="font-size:11.0pt">(CHO-s)</span><span b="" style="font-family:" zar=""> و محیط عاری از سرم مورد بررسی قرار گرفت.</span></span></span></span></span></span></span></span><br> <span style="font-size:12pt"><span style="text-justify:kashida"><span style="text-kashida:0%"><span style="line-height:normal"><span style="direction:rtl"><span style="unicode-bidi:embed"><span new="" roman="" style="font-family:" times=""><span b="" lang="FA" style="font-family:" zar=""><b>مواد و روش ها:</b>&nbsp;یک قطعه </span><span dir="LTR" style="font-size:11.0pt">DNA</span><span b="" lang="FA" style="font-family:" zar=""> متشکل از توالی های نوکلئوتیدی فاکتور 9 انسانی، جایگاه میانی ورود ریبوزوم و پروتئین فلورسنت سبز تقویت شده در وکتور بیانی </span><span dir="LTR" style="font-size:11.0pt">pcDNA3.1</span><span b="" lang="FA" style="font-family:" zar=""> تحت کنترل پروموتر سایتومگالو ویروس همسانه سازی شد. پلاسمید دوسیسترونی حاصل با استفاده از آنزیم برشگر </span><i><span dir="LTR" style="font-size:11.0pt">Bgl</span></i><span dir="LTR" style="font-size:11.0pt">II</span><span b="" lang="FA" style="font-family:" zar=""> خطی و در سلول‌های </span><span dir="LTR" style="font-size:11.0pt">CHO-s</span><span b="" style="font-family:" zar=""> ترانسفکت شد. سلول‌های ترنسفکت شده به مدت 14 روز تحت تیمار با ماده جنتیسین قرار گرفتند. سپس محیط کشت سلول‌های پایدار جمع‌آوری و بیان فاکتور 9 با استفاده از وسترن بلاتینگ و الایزا بررسی شد. فعالیت انعقادی نیز با روش کروموژنیک مورد ارزیابی قرار گرفت.<br> <strong>یافته ها</strong>: سلول های<font color="#0782c1">&nbsp;</font></span></span></span></span></span></span></span></span><span style="font-size:12pt"><span style="text-justify:kashida"><span style="text-kashida:0%"><span style="line-height:normal"><span style="direction:rtl"><span style="unicode-bidi:embed"><span new="" roman="" style="font-family:" times=""><span dir="LTR" style="font-size:11.0pt">CHO-s</span><span b="" style="font-family:" zar=""> نوترکیب و مقاوم به جنتیسین، زیر میکروسکوپ فلورسنت به رنگ سبز مشاهده شدند که حاکی از بیان و تجمع پروتئین فلورسنت سبز تقویت شده در سیتوپلاسم سلول‌ها بود. نتایج حاصل از وسترن بلاتینگ، بیان و ترشح فاکتور 9 نوترکیب به داخل محیط کشت را تائید کرد. مقدار فاکتور 9 ترشح شده </span><span dir="LTR" style="font-size:11.0pt">ng/mL/10⁶</span><span b="" lang="FA" style="font-family:" zar=""> 150 و فعالیت انعقادی آن </span><span dir="LTR" style="font-size:11.0pt">mU/mL</span><span b="" lang="FA" style="font-family:" zar="">&nbsp;0/2&nbsp;</span><span cambria="" lang="FA" style="font-family:">&plusmn;</span><span b="" lang="FA" style="font-family:" zar="">&nbsp;5/6 محاسبه شد.</span><span lang="FA" style="font-family:"B Zar""></span></span></span></span></span></span></span></span><br> <b><span dir="RTL" lang="FA" style="font-size:12.0pt"><span style="line-height:130%"><span b="" style="font-family:" zar="">نتیجه‌گیری: </span></span></span></b><span dir="RTL" lang="FA" style="font-size:12.0pt"><span style="line-height:130%"><span b="" style="font-family:" zar="">یافته های ما</span></span></span><span dir="RTL" lang="FA" style="font-size:12.0pt"><span style="line-height:130%"><span b="" style="font-family:" zar=""> نشان داد که این سیستم بیانی دو سیسترونی توانایی تولید هم‌زمان </span></span></span><span dir="RTL" lang="FA" style="font-size:12.0pt"><span style="line-height:130%"><span b="" style="font-family:" zar="">پروتئین فلورسنت سبز تقویت شده</span></span></span><span dir="RTL" lang="FA" style="font-size:12.0pt"><span style="line-height:130%"><span b="" style="font-family:" zar=""> و فاکتور 9 انسانی را در سلول‌های </span></span></span><span style="font-size:11.0pt"><span style="line-height:130%"><span new="" roman="" style="font-family:" times="">CHO-s</span></span></span><span dir="RTL" style="font-size:12.0pt"><span style="line-height:130%"><span b="" style="font-family:" zar=""> دارد. این سامانه بیانی، فرایند انتخاب و جداسازی سلول‌های بیان کننده فاکتور 9 را تسهیل می‌کند</span></span></span> <span style="font-size:12pt"><span style="text-justify:kashida"><span style="text-kashida:0%"><span style="line-height:normal"><span style="unicode-bidi:embed"><span new="" roman="" style="font-family:" times=""><b>Background and Aim</b>: The current treatment for hemophilia B is replacement therapy, which involves the intravenous infusion of human coagulation factor IX (hFIX) purified from plasma or a recombinant form produced in mammalian cells. In this study, using a bicistronic expression system, the stable expression of the hFIX in a serum-free and suspension-adapted Chinese hamster ovary cell line (CHO-s) was investigated.</span></span></span></span></span></span><br> <span style="font-size:12pt"><span style="text-justify:kashida"><span style="text-kashida:0%"><span style="line-height:normal"><span style="unicode-bidi:embed"><span new="" roman="" style="font-family:" times=""><b>Materials and Methods</b>: A DNA fragment consisting of hFIX, Internal Ribosome Entry Site (IRES) and Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) nucleotide sequences was cloned into pcDNA3.1 expression plasmid under the control of Cytomegalovirus (CMV) promoter. The bicistronic plasmid was then linearized using <i>Bgl</i>II restriction enzyme and transfected into CHO-s cells. The transfected cells were treated with geneticin for 14 days. The culture medium of the stable cells was then collected and the expression level of the hFIX were examined using western blotting and ELISA. The coagulation activity was also evaluated by the chromogenic method.</span></span></span></span></span></span><br> <span style="font-size:12pt"><span style="text-justify:kashida"><span style="text-kashida:0%"><span style="line-height:normal"><span style="unicode-bidi:embed"><span new="" roman="" style="font-family:" times=""><b>Results</b>: The recombinant CHO-s cells resistant to geneticin were observed under a fluorescence microscope in green color, which indicated the expression and accumulation of the EGFP in the cytoplasm of the cells. The results of Western blotting confirmed the expression and secretion of the hFIX into the culture medium. The amount of the secreted hFIX was 150 ng/mL/10⁶cells with a coagulation activity of 5.6 &plusmn;0.2 mU/mL.</span></span></span></span></span></span><br> <span style="font-size:12pt"><span style="text-justify:kashida"><span style="text-kashida:0%"><span style="line-height:normal"><span style="unicode-bidi:embed"><span new="" roman="" style="font-family:" times=""><b>Conclusion</b>: Our findings demonstrated that this bicistronic expression system could simultaneously produce EGFP and hFIX in CHO-s cells. This expression system facilitates selection and isolation of hFIX-expressing cells.</span></span></span></span></span></span> فاکتور 9 انعقادی انسانی, سلول تخمدان همستر چینی, پروتئین فلورسنت سبز تقویت شده, بیان دوسیسترونی. Human coagulation factor IX, Chinese hamster ovary cell, Enhanced green fluorescent protein, Bicistronic expression. 12 27 http://sjku.muk.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-5738-1&slc_lang=fa&sid=1 Fahimeh Ghasemi فهیمه قاسمی fahimeh.ghasemi@bums.ac.ir 5400319475328460057157 5400319475328460057157 No Assistant professor, Cell and molecular research center, Birjand university of medical sciences, Birjand, Iran استادیار، مرکز تحقیقات سلولی و مولکولی، دانشگاه علوم پزشکی بیرجند، بیرجند، ایران. Fatemeh Nikumanesh فاطمه نیکومنش g.nikoomanesh@yahoo.com 5400319475328460057158 5400319475328460057158 No Assistant professor,Infectious Diseases Research Center, Birjand University of Medical Sciences, Birjand, Iran استادیار، مرکز تحقیقات بیماری‌های عفونی، دانشگاه علوم پزشکی بیرجند، بیرجند، ایران Alireza Zomorodipour علیرضا زمردی پور zomorodi@nigeb.ac.ir 5400319475328460057159 5400319475328460057159 Yes Professor, Department of Molecular Medicine, Institute of Medical Biotechnology, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology (NIGEB),Tehran, Iran. استاد، گروه پزشکی مولکولی، پژوهشکده بیوتکنولوژی پزشکی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران