fa نقش سرین 310 در فعالیت آنزیمی و پروفایل دمایی کاسپاز-9 انسانی بیوتکنولوژی Biotechnology پژوهشي اصیل Original Research <span style="font-size:12pt"><span style="text-justify:kashida"><span style="text-kashida:0%"><span style="line-height:normal"><span style="direction:rtl"><span style="unicode-bidi:embed"><span new="" roman="" style="font-family:" times=""><b><span b="" lang="FA" style="font-family:" zar="">زمینه و هدف</span></b><span b="" lang="FA" style="font-family:" zar="">:</span> <span b="" lang="FA" style="font-family:" zar="">کاسپاز-9 یک آنزیم کلیدی در مسیر داخلی آپوپتوز است که فعالیت آن با سازوکارهای مختلفی مانند فسفریلاسیون تنظیم می&shy;شود. گزارش شده است که فسفریلاسیون سرین 310 در کاسپاز-9 موشی مانع پردازش آنزیم می&shy;شود. نقش این باقیمانده &shy;ی آمینواسیدی در فعالیت آنزیمی کاسپاز-9 انسانی نامشخص است. در این پژوهش اثر ایجاد بار منفی روی سرین 310 در فعالیت آنزیمی کاسپاز-9 انسانی مورد بررسی قرار گرفت.<br> <strong>مواد و روش ها:</strong></span></span></span></span></span></span></span></span><span style="font-size:12pt"><span style="text-justify:kashida"><span style="text-kashida:0%"><span style="line-height:normal"><span style="direction:rtl"><span style="unicode-bidi:embed"><span new="" roman="" style="font-family:" times=""><span b="" lang="FA" style="font-family:" zar=""><font color="#0782c1"><b>&nbsp;</b></font>با توجه به اینکه فسفریلاسیون منجر به ایجاد بار منفی در کاسپاز-9 می&shy;شود، کدون سرین 310 در کاسپاز-9 انسانی به کدون آسپارتات با استفاده از روش جهش &shy;زایی هدفمند </span><span dir="LTR" style="font-size:10.0pt">Quick change</span><span b="" lang="FA" style="font-family:" zar=""> جهش داده شد. کاسپاز-9 نوترکیب وحشی و جهش&shy; یافته در سویه باکتری </span><span dir="LTR" style="font-size:10.0pt">BL21(DE3)</span><span b="" lang="FA" style="font-family:" zar=""> بیان و با استفاده از کروماتوگرافی گرایشی تخلیص شدند. پروفایل دمایی و فعالیت کاسپاز-9 جهش&shy; یافته در مقایسه با آنزیم وحشی به کمک سوبسترای کروموژنیک </span><span dir="LTR" style="font-size:10.0pt">Ac-LEHD-pNA</span><span b="" style="font-family:" zar=""> در شرایط <i>برون&shy; تنی </i>سنجش شد. تجزیه و تحلیل آماری داده&shy; ها با آزمون </span><span dir="LTR" style="font-size:10.0pt">t</span><span b="" style="font-family:" zar=""> انجام شد.</span><span lang="FA" style="font-family:"B Zar""></span></span></span></span></span></span></span></span><br> <span style="font-size:12pt"><span style="text-justify:kashida"><span style="text-kashida:0%"><span style="line-height:normal"><span style="direction:rtl"><span style="unicode-bidi:embed"><span new="" roman="" style="font-family:" times=""><b><span b="" lang="FA" style="font-family:" zar="">&nbsp;یافته‌ها:</span></b> <span b="" lang="FA" style="font-family:" zar="">نتایج نشان داد که پارامترهای سینتیکی کاسپاز-9 جهش&shy; یافته &shy;ی </span><span dir="LTR" style="font-size:10.0pt">S310D</span><span b="" lang="FA" style="font-family:" zar=""> و آنزیم وحشی مشابه هستند؛ اما پروفایل دمایی آن‌ها متفاوت است.</span> <span b="" lang="FA" style="font-family:" zar="">آنزیم جهش &shy;یافته&shy; ی </span><span dir="LTR" style="font-size:10.0pt">S310D</span><span b="" lang="FA" style="font-family:" zar=""> در دمای 37 درجه&shy; ی سانتی&shy;گراد فعالیت بیشتر و در دماهای 4، 15، 45 و 60 درجه&shy; ی سانتی&shy;گراد فعالیت کمتری در مقایسه با آنزیم وحشی داشت.</span><span lang="FA" style="font-family:"B Zar""></span></span></span></span></span></span></span></span><br> <span style="font-size:12pt"><span style="line-height:normal"><span style="direction:rtl"><span style="unicode-bidi:embed"><span new="" roman="" style="font-family:" times=""><b><span b="" lang="FA" style="font-family:" zar="">نتیجه‌گیری:</span></b> <span b="" lang="FA" style="font-family:" zar="">ایجاد بار منفی بر روی سرین 310 در کاسپاز-9 بدون تأثیر بر پارامترهای سینتیکی سبب تغییر در پروفایل دمایی آنزیم<br> می&shy;شود.</span></span></span></span></span></span><br> &nbsp; <span style="font-size:12pt"><span style="line-height:normal"><span style="unicode-bidi:embed"><span style="font-family:&quot;Times New Roman&quot;,&quot;serif&quot;"><b>Background and Aim:</b> Caspase-9 is a key enzyme in the intrinsic pathway of apoptosis that its activity is regulated by various mechanisms such as phosphorylation. It has been reported that phosphorylation of serine 310 in murine caspase-9 prevents enzyme processing. The role of this residue in human caspase-9 activity in not clear. In this study we investigated the effect of negative charge on serine 310 in caspase-9 activity.</span></span></span></span><br> <span style="font-size:12pt"><span style="line-height:normal"><span style="text-autospace:none"><span style="unicode-bidi:embed"><span style="font-family:&quot;Times New Roman&quot;,&quot;serif&quot;"><b>Materials and Methods:<i> </i></b>Considering that phosphorylation leads to negative charge on caspase-9, the codon of serine 310 in human capsase-9 was mutated to aspartate via quick change site-directed mutagenesis. Recombinant wild type and mutant caspase-9 were expressed in BL21(DE3) and purified by affinity chromatography. The temperature profile and activity of the mutant caspase-9 were assessed by chromogenic substrate of Ac-LEHD-pNA <i>in vitro, </i>and compared to those of wild enzyme. Student&rsquo;s t test was used for data analysis.</span></span></span></span></span><br> <span style="font-size:12pt"><span style="line-height:normal"><span style="text-autospace:none"><span style="unicode-bidi:embed"><span style="font-family:&quot;Times New Roman&quot;,&quot;serif&quot;"><b>Results:<i> </i></b>The<b><i> </i></b>results showed that kinetics parameters of S310D mutant and wild type caspase-9 were similar, but their temperature profiles were different. Comparison of S310D mutant enzyme and wild type caspase-9 showed that S310D mutant enzyme had higher activity at 37 ^oC and lower activity at 4, 15, 45 and 60 ^oC.</span></span></span></span></span><br> <span style="font-size:12pt"><span style="line-height:normal"><span style="unicode-bidi:embed"><span style="font-family:&quot;Times New Roman&quot;,&quot;serif&quot;"><b>Conclusion: </b>In our study<b>, </b>the negative charge on serine 310 in caspase-9 led to change in the profile temperature of the enzyme with no effect on kinetic parameters.</span></span></span></span> کاسپاز, سنجش آنزیمی, آپوپتوز, جهش‌زایی Caspase, Enzyme assay, Apoptosis, Mutagenesis 13 24 http://sjku.muk.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-6618-1&slc_lang=fa&sid=1 Raheleh Shakeri راحله شاکری r.shakeri@uok.ac.ir 5400319475328460054036 5400319475328460054036 Yes Assistant Professor, Department of Biological Science, Faculty of Science, University of Kurdistan, Sanandaj, Iran استادیار، گروه علوم زیستی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه کردستان، سنندج، ایران Mohadeseh Mahmoudian محدثه محمودیان mohadeseh.mahmodi.m@gmail.com 5400319475328460054037 5400319475328460054037 No MSc Student, Department of Biological Science, Faculty of Science, University of Kurdistan, Sanandaj, Iran دانشجوی کارشناسی ارشد، گروه علوم زیستی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه کردستان، سنندج، ایران Reza Khodarahmi رضا خدارحمی drrezakhodarahmi@gmail.com 5400319475328460054038 5400319475328460054038 No Professor, Medical Biology Research Center, Health Technology Institute, Kermanshah University of Medical Sciences, Kermanshah, Iran استاد، مرکز تحقیقات بیولوژی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی کرمانشاه، کرمانشاه، ایران Soheila Mohammadi سهیلا محمدی soh.moh90@gmail.com 5400319475328460054039 5400319475328460054039 No Assistant Professor, Pharmaceutical Sciences Research Center, Health Institute, Kermanshah University of Medical Sciences, Kermanshah, Iran. استادیار، مرکز تحقیقات علوم دارویی، دانشگاه علوم پزشکی کرمانشاه، کرمانشاه، ایران