:: دوره 27، شماره 6 - ( مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی کردستان 1401 ) ::
جلد 27 شماره 6 صفحات 24-13 برگشت به فهرست نسخه ها
نقش سرین 310 در فعالیت آنزیمی و پروفایل دمایی کاسپاز-9 انسانی
راحله شاکری1 ، محدثه محمودیان2 ، رضا خدارحمی3 ، سهیلا محمدی4
1- استادیار، گروه علوم زیستی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه کردستان، سنندج، ایران ، r.shakeri@uok.ac.ir
2- دانشجوی کارشناسی ارشد، گروه علوم زیستی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه کردستان، سنندج، ایران
3- استاد، مرکز تحقیقات بیولوژی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی کرمانشاه، کرمانشاه، ایران
4- استادیار، مرکز تحقیقات علوم دارویی، دانشگاه علوم پزشکی کرمانشاه، کرمانشاه، ایران
چکیده:   (3240 مشاهده)
زمینه و هدف: کاسپاز-9 یک آنزیم کلیدی در مسیر داخلی آپوپتوز است که فعالیت آن با سازوکارهای مختلفی مانند فسفریلاسیون تنظیم می­شود. گزارش شده است که فسفریلاسیون سرین 310 در کاسپاز-9 موشی مانع پردازش آنزیم می­شود. نقش این باقیمانده ­ی آمینواسیدی در فعالیت آنزیمی کاسپاز-9 انسانی نامشخص است. در این پژوهش اثر ایجاد بار منفی روی سرین 310 در فعالیت آنزیمی کاسپاز-9 انسانی مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روش ها:
 با توجه به اینکه فسفریلاسیون منجر به ایجاد بار منفی در کاسپاز-9 می­شود، کدون سرین 310 در کاسپاز-9 انسانی به کدون آسپارتات با استفاده از روش جهش ­زایی هدفمند Quick change جهش داده شد. کاسپاز-9 نوترکیب وحشی و جهش­ یافته در سویه باکتری BL21(DE3) بیان و با استفاده از کروماتوگرافی گرایشی تخلیص شدند. پروفایل دمایی و فعالیت کاسپاز-9 جهش­ یافته در مقایسه با آنزیم وحشی به کمک سوبسترای کروموژنیک Ac-LEHD-pNA در شرایط برون­ تنی سنجش شد. تجزیه و تحلیل آماری داده­ ها با آزمون t انجام شد.
 یافته‌ها: نتایج نشان داد که پارامترهای سینتیکی کاسپاز-9 جهش­ یافته ­ی S310D و آنزیم وحشی مشابه هستند؛ اما پروفایل دمایی آن‌ها متفاوت است. آنزیم جهش ­یافته­ ی S310D در دمای 37 درجه­ ی سانتی­گراد فعالیت بیشتر و در دماهای 4، 15، 45 و 60 درجه­ ی سانتی­گراد فعالیت کمتری در مقایسه با آنزیم وحشی داشت.
نتیجه‌گیری: ایجاد بار منفی بر روی سرین 310 در کاسپاز-9 بدون تأثیر بر پارامترهای سینتیکی سبب تغییر در پروفایل دمایی آنزیم
می­شود.

 
واژه‌های کلیدی: کاسپاز، سنجش آنزیمی، آپوپتوز، جهش‌زایی
متن کامل [PDF 1084 kb]   (1035 دریافت)    
نوع مطالعه: پژوهشي اصیل | موضوع مقاله: بیوتکنولوژی
دریافت: 1400/10/26 | پذیرش: 1401/3/25 | انتشار: 1401/12/12
فهرست منابع
1. Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wideranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer. 1972;26(4):239-57.
2. McIlwain DR, Berger T, Mak TW. Caspase functions in cell death and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2013;5(4):a008656.
3. Shakeri R, Kheirollahi A, Davoodi J. Apaf-1: Regulation and function in cell death. Biochimie. 2017;135:111-25.
4. Cardone MH, Roy N, Stennicke HR, Salvesen GS, Franke TF, Stanbridge E, et al. Regulation of cell death protease caspase-9 by phosphorylation. Science. 1998;282(5392):1318-21.
5. Allan LA, Morrice N, Brady S, Magee G, Pathak S, Clarke PR. Inhibition of caspase-9 through phosphorylation at Thr 125 by ERK MAPK. Nat Cell Biol. 2003;5(7):647-54.
6. Martin MC, Allan LA, Lickrish M, Sampson C, Morrice N, Clarke PR. Protein kinase A regulates caspase-9 activation by Apaf-1 downstream of cytochrome c. J Biol Chem. 2005;280(15):15449-55.
7. Dai J, Jin W-H, Sheng Q-H, Shieh C-H, Wu J-R, Zeng R. Protein phosphorylation and expression profiling by Yin-yang multidimensional liquid chromatography (Yin-yang MDLC) mass spectrometry. J Proteome Res. 2007;6(1):250-62.
8. Li P, Zhou L, Zhao T, Liu X, Zhang P, Liu Y, et al. Caspase-9: structure, mechanisms and clinical application. Oncotarget. 2017;8(14):23996-24008.
9. Allan LA, Clarke PR. Apoptosis and autophagy: regulation of caspase‐9 by phosphorylation. FEBS J. 2009;276(21):6063-73.
10. Fisher CL, Pei GK. Modification of a PCR Based Site-Directed Mutagenesis Method. Biotechniques. 1997;23(4):570-4.
11. Kurokawa M, Kornbluth S. Caspases and kinases in a death grip. Cell. 2009;138(5):838-54.
12. Serrano BP, Hardy JA. Phosphorylation by protein kinase A disassembles the caspase-9 core. Cell Death Differ. 2018;25(6):1025-39.
13. Almeida VM, Marana SR. Optimum temperature may be a misleading parameter in enzyme characterization and application. PLoS One. 2019;14(2):e0212977.
14. Huber KL, Serrano BP, Hardy JA. Caspase-9 CARD: core domain interactions require a properly formed active site. Biochem J. 2018;475(6):1177-1196.
15. Garcia-Calvo M, Peterson EP, Rasper DM, Vaillancourt JP, Zamboni R, Nicholson DW, et al. Purification and catalytic properties of human caspase family members. Cell Death Differ. 1999;6(4):362-369.
16. Yin Q, Park HH, Chung JY, Lin S-C, Lo Y-C, da Graca LS, et al. Caspase-9 holoenzyme is a specific and optimal procaspase-3 processing machine. Mol Cell. 2006;22(2):259-268.



XML   English Abstract   Print



بازنشر اطلاعات
Creative Commons License این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است.
دوره 27، شماره 6 - ( مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی کردستان 1401 ) برگشت به فهرست نسخه ها